Reparo de Defeito ósseo perene em crânio de cobaia
pela aplicação de osseobond

R. Taga*, T. M. Cestari**, T. L. Silva*** e A. C. M. Stipp****

RESUMO

    Na presente pesquisa avaliamos o potencial do Osseobond (matriz óssea bovina desmineralizada) no reparo de defeitos ósseos perenes provocados em crânios de cobaias. Um total de 24 defeitos ósseos de 8 mm de diâmetro foi produzido com trefina cirúrgica na calvária de 12 cobaias machos e adultos. Em cada animal, um defeito foi preenchido com partículas de Osseobond aglutinadas com sangue do próprio animal e o outro com coágulo sanguíneo. As calvárias de grupos de 4 cobaias, foram coletadas após 1, 3 e 6 meses. Os espécimes descalcificados foram processados e cortes histológicos semi-seriados de 6um foram obtidos. A análise histológica indicou que: a) todos os defeitos ósseos preenchidos somente com coágulo sanguíneo estavam totalmente abertos e continham tecido conjuntivo fibroso; e b) nos defeitos ósseos preenchidos com Osseobond, as partículas foram reabsorvidas, em quase sua totalidade já após 3 meses. Aos 6 meses de espaço da lesão estava totalmente ocupado por tecido ósseo em estado avançado de organização; em um caso desse grupo, permaneceu uma pequena abertura lateral. O processo de reabsorção da matriz óssea liofilizada e de reparo ósseo foi acompanhado pela análise histológica.

UNITERMOS

    Matriz óssea liofilizada; Reparo ósseo; Defeito ósseo craniano.

ABSTRACT

    In present work we evaluated the Osseobond (Iyophilized bovine bone matrix) potential to promote reparation of Guinea pig perennial skull defects. A total of 24 critical size osseous defects with 8 mm diameter were made in 12 male adult Guinea pigs. From each animal, one defect was filled with Osseobond powder aglutinated with whole blood and the other defect with blood clot. The skulls of groups of 4 animaIs, were obtained after 1,3 and 6 months. Decalcified specimens were processed and 6 um semi-serial sections were made. Histological analysis indicated that: a) the cranial defects filled only with blood clots did not exhibited bone formation, since they were filled with fibrous connective tissue; and b) in the skull critical sinze defects packed with Osseobond powder mixed with whole blood, the bone matrix particles were almost completely resorbed already by 3 months, and after 6 moths the bone defects spaces were total or sometimes, almost that totally occupied by organized bone tissue. The process of lyophilized bone matrix resorption and of bone reparation was histologically accompained at the light microscope.

UNITERMS

    Lyophilized bone matrix; Bone repare; Osseous cranial defect.

INTRODUÇÃO

    Uma das características biológicas do tecido ósseo é a sua alta capacidade de reparação espontânea quando lesionado, repondo depois de breve intervalo de tempo toda a porção perdida.

    No entanto em alguns casos, defeitos ósseos às vezes extensos, produzidos por trauma, processos patológicos, anomalias do desenvolvimento, etc., não tem a capacidade de repararem-se espontaneamente, havendo necessidade, nesses casos, do médico ou cirurgião-dentista utilizar-se de várias técnicas cirúrgicas na tentativa de reparação da deficiência óssea.

    A partir dos trabalhos pioneiros de URIST (1965) e REDDI e BUGGINS (1972) que mostraram que a osteogênese heterotópica podia ser induzida por matriz óssea desvitalizada e desmineralizada, surgiu uma nova alternativa para o tratamento de lesões ósseas perenes na área médica e odontológica; a da utilização de matriz óssea alogênica submetida a procedimentos especiais de preparo, como a eliminação de células por autólise e extração de antígenos matriciais, para induzir a formação de novo osso (URIST et al., 1973; URIST et al., 1975: MULLIKEN et al., 1981).

    Pesquisas desenvolvidas posteriormente demonstraram que a capacidade osteoindutiva da matriz óssea desmineralizada, era devido a presença de fatores de crescimento protéicos e solúveis no seu interior (REDDI e ANDERSON, 1976).

    Em 1984, URIST et al. isolaram e purificaram uma proteína de osso bovino, que foi designada de proteína morfogenética óssea ("BMP"). A seguir, vários outros estudos foram publicados descrevendo o isolamento de fatores matriciais ósseos indutores de osteogênese (SAMPATH et al., 1987; LUYTEN et al, 1989; BENTZ et al., 1989; BESSO et al., 1992).

    Na atualidade com o avanço da biotecnologia de recombinação genética, foi possível produzir e caracterizar várias proteínas morfogenéticas ósseas humanas a BMP -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 e -8 (WOZNEY et al., 1988; CELESTE et al., 1990; OZKAYNAK et al., 1990); SAMPATH et al., 1990).

    Apesar desses avanços, o tratamento de lesões ósseas com matriz óssea liofilizada humana em partículas, é uma alternativa de tratamento utilizada até hoje, principalmente na área odontológica. No entanto, devido ao seu alto custo e a dificuldade de obtenção de osso humano viável em quantidade, associada a proibição em vários países da comercialização de produtos de órgãos ou tecidos humanos, foram lançados no mercado brasileiro e europeu, produtos originados de osso bovino, com as mesmas finalidades.

    

    

    

Figura 1: Etapa cirúrgica do experimento: a) incisão sagital na região fronto-parietal; b) descolamento lateral dos retalhos e exposição da superfície óssea do crânio, c) d) e) e f) várias fases para a obtenção dos dois defeitos ósseos de 8 mm de diâmetro, veja na imagem f) o cérebro recoberto pelas meninges no fundo dos defeitos; g) a matriz liofilizada utilizada; h) o defeito anterior preenchido por matriz aglutinada com o próprio sangue, o outro defeito será preenchido a seguir por coágulo sanguíneo; e i) a sutura realizada.

    A utilização desses produtos baseia-se no relativo sucesso da utilização da BMP bovina no tratamento de centenas de extensas lesões ósseas humanas de face e crânio (SAILER e KOLB, 1994) e a homologia comprovada pela clonagem de DNA, das BMPs humanas com as de osso bovino (RIPAMONTI e REDDI, 1994).

    Desse modo, o objetivo da presente pesquisa foi de avaliar a capacidade de matriz óssea liofilizada bovina, comercialmente designada de OSSEOBOND, de estimular o reparo de lesões ósseas perenes produzidas cirurgicamente em crânios de cobaias.

    

    

     

     O teste biológico da capacidade da matriz óssea bovina liofilizada em partículas (Osseobond) promover reparação de lesões ósseas perenes, foi realizado em12 cobaias (Cavia porcellus) machos adultos, com massa corporal ao redor de 500g, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Bauru - USP.

    Os 12 animais foram divididos em 3 grupos de 4 animais cada, de acordo com os períodos experimentais de 1,3 e 6 meses, após O implante de matriz liofilizada.

    As cirurgias foram realizadas com os animais sob anestesia geral com Nembutal sódico (marca Abbott Laboratórios do Brasil) na dose de 500mg por kg de massa corporal. Após a anestesia realizamos a tricotomia da região fronto-parietal da cabeça do animal com auxílio de tesoura e lâmina de barbear e a assepsia vigorosa com idofor alcoólico. A xilocaína a 2% com Norepinefrina1: 50.000 (Merrell Lepetit Farmacêutica e Industrial LTDA.) foi utilizada para anestesia infiltrativa local. Em seguida, com um bisturi, foi feita uma incisão sagital no tegumento de revestimento do crânio, acompanhando a junção dos ossos parietais e penetrando na região do osso frontal (Figura 1a). Com auxílio de um destaca periósteo e um cinzel, levantamos os retalhos lateralmente expondo amplamente a cortical óssea da região (Figura 1 b). A seguir com trefina cirúrgica de 8mm de diâmetro e irrigação abundante e contínua com solução fisiológica (Figura 1c e 1d) foram realizadas duas perfurações transpassando toda espessura do diploe e expondo a dura-máter no fundo das lesões (Figura 1e e 1f).

     A perfuração anterior foi preenchida com matriz óssea bovina liofilizada da marca Osseobond (Figura 1g), aglutinada com sangue do próprio animal e a posterior com coágulo sanguíneo (Figura 1h). Os retalhos foram a seguir recolocados em sua posição e suturados com linha de seda preta nº 3-0 (Ethicon - Johnson & Johnson), (Figura 1i).

    Os três grupos de cobaias foram sacrificados, respectivamente, 1, 3 e 6 meses após as cirurgias, e as suas calotas cranianas foram retiradas com a pele sobreposta e imediatamente colocadas em solução de formol a 10% em tampão fosfato, onde permaneceram em processo de fixação histológica por 1 semana.

    

    

    As peças histológicas foram a seguir, submetidas a descalcificação em solução de ácido fórmico a 50% e citrato de sódio a 20% (1:1) durante aproximadamente 1 mês. Após serem lavados por uma noite em água corrente, as peças sofreram processamento histológico estandardizado de desidratação em soluções de concentração crescente de etanol, diafanização em xilol e inclusão em Paraplast.

    Cortes histológicos com 6mm de espessura foram obtidos em micrótomo Multicult - Leica -Jung, e corados pelas técnicas da Hematoxilina -Eosina (H.E. ) e Tricrômico de Masson (T. .M. ) modificado por Goldner.

RESULTADOS

     Nessa pesquisa, todos os animais mantiveram-se com excelente saúde durante todo o transcorrer do período experimental, mesmo nos dias subseqüentes aos procedimentos pós-operatórios. Em nenhum dos casos foi necessário a utilização de medicamento tipo antibiótico ou antiflamatório no período pós-cirúrgico de recuperação.

    A análise histológica mostrou que todos os defeitos ósseos que foram preenchidos somente com coágulo sanguíneo, de sangue total do próprio animal, não sofreram reparo por tecido cartilaginoso ou ósseo, em nenhum dos períodos analisados, mesmo no mais longo de 6 meses. Todos os defeitos ósseos estavam preenchidos com tecido fibroso de espessura bem menor do que a do osso da borda da lesão (veja as Figura2a, b e c; 3a e4a). Em alguns poucos casos foi possível notar um pequeno crescimento na borda óssea em um dos lados ou às vezes também do outro lado.

     

    

   

    Os defeitos ósseos que sofreram implantação de partículas de matriz óssea liofilizada (OSSEBOND) aglutinadas com sangue total do próprio animal, exibiram todos eles, processo de reparação óssea, de tal maneira que decorridos 6 meses, estavam preenchidos totalmente ou em certos casos, quase que totalmente por tecido ósseo organizado (veja as Figuras 4b, c, d, e,f, g, h e i). Em um caso, a lesão estava totalmente preenchida por tecido ósseo aos 3 meses pós-implantação (Figura 3e e 3.f).

    No grupo de 1 mês de pós-operatório, verificou-se entre as partículas de matriz óssea liofilizada, invasão de vasos sanguíneos acompanhada de enorme contingente de célula de tecido conjuntivo (Figuras 2d, e, f ,g e i). Nesse período foi possível observar partículas quase que intactas, e outras, em diferentes fases do processo de reabsorção (veja as Figuras 2d, h e i), o que nos permitiu seqüênciar os eventos que acontecem e levam a reabsorção das partículas de matriz óssea implantada. Assim, verificou-se que ocorre: a) invasão dos canais ósseos nas partículas de matriz por vasos e células mononucleadas (Figuras 2d e h); b) recobrimento da superfície externa das partículas por células mononucleadas, onde raramente observou-se células multinucleadas (Figura 2h); c) os canalículos ósseos das partículas tornam-se bem visíveis; . d) a superfície da matriz liofilizada começa a exibir aspecto corroído (Figura 2h); e) as partículas de matriz óssea passa a exibir também basofilia; e 1) a matriz começa a ser internamente destruída, assumindo cada vez mais, aspecto rarefeito (Figura 2g e i).

    Nesse grupo, tecido ósseo novo só foi observado próximo da borda da lesão ou em pequenos focos presentes ocasionalmente entre as partículas de matriz liofilizada (Figura 2e,f e g).

    No grupo de 3 meses, um dos casos estava com o espaço do defeito totalmente fechado por tecido ósseo (Figura 3e e 1). Nos demais casos, o espaço estava "parcialmente fechado de modo variável, ou seja, uns mais e outros menos. Todos com defeito ósseo crescendo das bordas e alguns com focos de ossificação na porção intermediária de lesão (Figuras 3c e d).

    Aos 6 meses, todos os casos, estavam ou totalmente fechados ou em fase de quase total fechamento (Figuras 4b, c ,d , e, f, g, h e i).

    Nesses casos e no de fechamento total aos 3 meses, a análise dos cortes histológicos nos sugeriu que o reparo ósseo seja multifocal, com os focos de ossificação reparadora crescendo e fusionando-se em si, modelando gradativamente a arquitetura óssea e vascular (acompanhe as imagens das Figuras 4d, e,f e i).

    Em todos os casos a espessura total do tecido ósseo formado era menor que a pré-existente nas bordas da lesão.     Convém salientar, que no grupo de 6 meses foi possível observar no interior do tecido ósseo formado, áreas exibindo basofilia, contendo células maiores e envoltas por um halo de matriz mais basofílico. Também foram observadas imagens sugerindo ocorrência em baixo nível, de incorporação de pequenas porções de matriz liofilizada ao osso formado, (Figura 4.f).

DISCUSSÃO

     O tratamento de lesões ósseas crânio-buco-faciais extensas deve ser realizada pela técnica do enxerto ósseo autógeno, quando o tecido ósseo vital é retirado de uma área doadora e rapidamente transferido para o local de lesão, mas esse procedimento nem sempre pode ser realizado pelo cirurgião devido a dificuldade de obtenção de tecido ósseo suficiente da área doadora.

     Uma alternativa viável de tratamento é a utilização de matriz óssea alogênica desmineralizada submetida a procedimentos especiais de preparo (URIST et al., 1973; URIST et al., 1915; MULLIKEN et al., 1981), para preenchimento do espaço da lesão, na expectativa de formação de novo tecido ósseo na região.

    Esse procedimento baseia-se na presença no interior da matriz orgânica óssea de inúmeros fatores de crescimento ósseo de natureza protéica, genericamente designados de proteína morfogenética óssea ou BMP ("Bone Morphogenetic Protein"), que quando liberados da matriz óssea, induziram um processo em cascata que levariam a formação de novo tecido ósseo por ossificação endocondral.

     Essas proteínas já foram isoladas na forma pura de ossos de vários animais, como o boi, coelho, rato, rena, porco, babuíno, etc. (URIST et al., 1984; SAMPATH et al.,1987; LUYTEN et al., 1989, BENTZ et al., 1989, BESSHO et al.,1992; JORTIKKA et al., 1993; RIPAMONTI et al., 1992), de osteosarcoma humano (ANDERSON et al., 1995) e as humanas produzidas e caracterizadas pela biotecnologia de recombinação genética (WOZNEY et al., 1988; SAMPATH et al., 1990). Um fato interessante nessas pesquisas de recombinação genética, foi a constatação pela técnica de clonagem de DNA de homologia entre as BMPs recombinantes humanas (rhBMPS) e as BMPs nativas isoladas de matriz óssea de vários animais, assim por exemplo, a seqüência de aminoácido da osteogenina, uma proteína osteogênica isolada de osso bovino, é idêntica à rh BMP-3 (citado em RIPAMONTI e REDDI, 1994).

    Em vários artigos publicados (RIPAMONTI e REDDI, 1994; REDDI, 1992 e 1995), os autores têm chamado atenção sobre as enormes possibilidades de aplicação clínica dessas BMPs no estímulo à regeneração de defeitos ósseos crânio-buco-faciais. URIST et al., em 1983, já havia comentado sobre essas possibilidades, no entanto, tinha salientado, que isso só seria viável se desenvolvessem métodos para a obtenção a custo menor, de quantidades ilimitadas dessas proteínas indutoras da osteogênica.

    Como isso ainda não é possível, a matriz óssea liofilizada humana continua sendo amplamente utilizada principalmente na área odontológica.

    Uma vez que é muito difícil a obtenção de osso humano viável em quantidade, isento de vírus como o da AIDS e da hepatite B, aliada à proibição pelas leis de vários países, de comercialização de órgãos humanos ou de suas partes, tem levado ao lançamento no mercado de biomateriais, de matriz óssea liofilizada de origem bovina preparada à semelhança da humana, como uma alternativa no tratamento de lesões ósseas permanentes.

    Cumpre ressaltar, que a utilização dessa matriz xenogênica se baseia na já comentada homologia das BMPs bovinas com as humanas (consultar a revisão de RIPAMONTI e REDDI, 1994), e no fato, das BMPs isoladas de osso bovino, já estarem sendo utilizadas com grande sucesso, no tratamento de centenas de pacientes com lesões ósseas permanentes na região de crânio e face (consultar o trabalho de SAILER e KOLB, 1994).

     Na atual pesquisa, testou-se a capacidade de uma dessas matrizes liofilizadas, comercialmente conhecida como OSSEOBOND, induzir reparação de lesão óssea permanente produzida experimentalmente em crânios de cobaias.

    Esse sistema de teste é de grande valia, uma vez que, todos os defeitos ósseos controles preenchidos somente com coágulo sanguíneo, não sofreram regeneração óssea, mesmo 6 meses após os procedimentos cirúrgicos.

    Como já foi salientado anteriormente, a matriz óssea desmineralizada alogênica, ou seja, da mesma espécie animal, tem capacidade de induzir a formação de novo tecido ósseo em um processo multifásico em cascata de ossificação endocondral, com a formação de tecido cartilaginoso e ósseo em quantidade, já após duas semanas da sua implantação (URIST et al., 1982; VANDERSTEENHOVEN e SPECTOR, 1983; REDDI I et al., 1987; RABIE et al., 1996).

    Quanto à matriz óssea desmineralizada xenogênica, ou seja, de outra espécie animal, testes realizados com matriz humana, de macaco e bovina em sítio ectópico de ratos, mostraram ausência de indução da osteogênese para as duas primeiras matrizes e fraco efeito para a matriz bovina (SAMPATH e REDDI, 1983), no entanto, nessa mesma pesquisa, frações protéicas de extratos em guanidina-HCI, obtidos dessas mesmas matrizes por cromatografia em gel, mostraram alta capacidade de indução de osteogênese ectópica em ratos, quando reconstituídos com matriz óssea colagenosa inativa (sem as BMPs nativas) de rato.

    Então qual seria o motivo de baixa atividade da matriz desmineralizada xenogênica mantida intacta em induzir a osteogênese? Fatores antigênicos presentes nessa matriz xenogênica, poderiam estar provocando o bloqueio da atividade das proteínas sabidamente existentes no interior da matriz, no entanto, deve-se salientar, que os testes foram sempre realizados em sítio heterotópico, onde às condições microambientais associadas a fatores imunológicos, poderiam estar impedindo as BMPs de manifestarem os seus efeitos biológicos.

    O modelo utilizado na presente pesquisa foi de avaliar a capacidade osteogênica de matriz óssea xenogênica em sítio ortotópico, ou seja, em sítio ósseo, onde as condições microambientais são mais favoráveis a ocorrência ele osteogênese induzida. Os resultados obtidos mostraram que a matriz liofilizada bovina induziu após 6 meses, e às vezes já aos 3 meses, o fechamento total para alguns casos e quase que total para outros, de defeitos ósseos de 8mm produzidos em crânios de cobaias. Como todos os defeitos ósseos controles mantiveram-se abertos, os resultados por nós obtidos tem alta relevância, uma vez que, o reparo ósseo que ocorreu nos defeitos ósseos tratados, só pode ser atribuído à matriz óssea liofilizada bovina utilizada no preenchimento das lesões.

    No entanto, alguns fatos que ocorreram durante esse reparo, devem ser salientados em comparação como o processo de reparo de lesão semelhante induzido por matriz óssea alogênica desmineralizada, por exemplo: um atraso nos eventos que levam ao processo de osteogênese, a menor intensidade osteoindutiva ou osteocondutiva, uma vez que, a espessura da cortical óssea formada foi sempre menor que a originalmente existente na região e a não ocorrência de fechamento completo em todos os casos. Essas diferenças, como já foi comentado, podem ser devidas aos componentes imunológicos presentes na matriz óssea bovina, que de alguma maneira, atuariam modulando os eventos em cascata que ocorrem durante a indução à osteogênese, ou então, como no nosso experimento, não foi utilizado membrana biológica para funcionar como barreira protetora da zona do defeito, células do tecido conjuntivo da pele poderiam ter invadido o espaço da lesão, concomitantemente às células de origem óssea, prejudicando a regeneração óssea.

    Convém salientar, que RIPAMONTI et al. (1996) testando a capacidade osteoindutora da proteína osteogênica humana-l recombinante associada a matriz colagenosa inativa alogênica e xenogênica (bovina) em lesões ósseas de tamanho crítico em crânios de babuíno, obtiveram alta atividade osteogenética como a utilização de ambas matrizes, com pequenas diferenças na velocidade de remodelação com vantagens para a matriz alogênica, mas segundo os autores, os resultados favoráveis obtidos, com a matriz bovina, sugeriram que, a matriz humana não é um fator indispensável para a utilização terapêutica futura das BMPs humanas recombinantes.

    Os resultados obtidos na presente pesquisa, mostraram que a matriz liofilizada bovina tem capacidade de estimular a formação de novo tecido ósseo em sítio ortotópico de cobaias, isto vem reforçar as possibilidades de sua utilização na clínica odontológica.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS