Tratamento de defeito ósseo perene em
calvária de cobaia com membrana de cortical
óssea bovina liofilizada associada ou não a
enxerto ósseo bovino desmineralizado

Percyleine Pelegrine HERCULIANI, Tania Mary CESTARl, Eulázio Mikio TAGA e Rumio TAGA

Resumo
    Com o objetivo de estudar o processo de reparo ósseo com a utilização de membrana de cortical óssea bovina (Gen-derm), associada ou não a enxerto ósseo bovino desmineralizado (Gen-ox), foram confeccionados defeitos cirúrgicos de 12 mm de diâmetro na calvária de 37 cobaias (Cavia porcellus). Os animais foram divididos em dois grupos de 15 animais cada, um grupo controle com 5 e um grupo 0 hora com 2 animais. No primeiro grupo, a lesão foi preenchida com coágulo sanguíneo do próprio animal e recoberta com membrana; no segundo, a lesão foi preenchida com matriz óssea bovina desmineralizada, aglutinada com coágulo e recoberta com membrana; no grupo controle e no 0 hora não foi utilizado nenhum tratamento. As calvárias dos grupos experimentais, em sub grupos de 5 animais, foram coletadas 1, 3 e 6 meses após as cirurgias, o grupo controle após 6 meses e o 0 hora logo após a cirurgia. As peças obtidas foram submetidas à análise radiográfica e histológica. A análise dos resultados mostrou que todos animais do grupo controle apresentaram o defeito preenchido com menor quantidade de tecido ósseo formado à partir da sua borda do que nos grupos experimentais e grande quantidade de tecido conjuntivo no espaço da lesão. O grupo recoberto apenas com membrana apresentou significativo crescimento ósseo na borda, chegando ao final de 6 meses com 52% da área da lesão ocupada por tecido ósseo. No grupo tratado com matriz liofilizada bovina e membrana, a formação óssea periférica à partir da borda foi menor que o do grupo anterior, no entanto, ao final de 6 meses, 62% do espaço da lesão estava preenchido por novo tecido ósseo. Neste caso, o crescimento ósseo ocorreu principalmente em forma de ilhas no interior da lesão. Embora em nenhum dos casos tenha ocorrido o fechamento completo da lesão, a formação de maior quantidade de tecido ósseo no grupo tratado com enxerto ósseo bovino e membrana em relação ao controle, mostrou que este tipo de tratamento pode ser uma alternativa no tratamento cinírgico de lesões ósseas perenes de menor tamanho na boca.

Palavras-Chave
    Regeneração óssea, defeito de tamanho crítico, matriz óssea desmineralizada, membrana absorvível

Abstract
    Aiming to study the bone repair by the utilization of bovine bone cortical membrane (Gen-derm), associated or not to a demineralized bovine bone graft (Gen-ox), surgical defects of 12 mm diameter were made in calvarium of 37 guinea pigs (Cavia porcellus). The animals were divided into 2 experimental groups of 15 animais each, a control group with 5 and a 0 hour group with 2 animals. ln the first experimental group the lesion was filled with animal blood clot and covered with membrane; in the second, the lesion was filled with demineralized bovine graft, agglutinated with clot and reshield with membrane; and in the control and 0 hour groups solely blood clot were used. The calvariums of the experimental groups, in sub-groups of 5 animais, were collected 1, 3 and 6 months after the surgeries, the control group after 6 months, and the 0 hour one right after the surgery. The radiographic, histologic and morphometric analyses showed that alI the animais from the control group have presented a lower arnount of bone tissue in the barder of the defect, and agreater amount of connective tissue on the lesion space. The group reshield with membrane showed bone growth at the edge, 52% of the lesion area filled with bone tissue after 6 months. In the group treated with demineralized bovine matrix and membrane, bone growth occurred mainly in the form of islands inside lesions, and at the end of 6 months, 62% of the lesion area was filled by new bone tissue. Although a complete closing of the lesion not occurred in neither of the cases, the larger arnount of bone tissue formed in the group filled with bovine bone graft and membrane when compared to the control group, showed that this kind of treatment may be an altemative for surgical treatment of minor size perennial bony lesions in the mouth.

KeyWords
    Bone regeneration, critical-size defect, demineralized bone matrix, absorbable membrane

Introdução
    O osso sendo resistente e rígido, representa o principal elemento de sustentação do corpo. O tecido altamente mineralizado que o constitui, o tecido ósseo, exibe além das suas propriedades mecânicas uma alta capacidade de regeneração espontânea. Assim, fraturas ou defeitos ósseos são curados com a produção de novo tecido ósseo com a mesma alta organização estrutural do tecido original. No entanto, esta capacidade regenerativa é limitada pelo tamanho da lesão, assim defeitos ósseos extensos, provocados por traumas, infecções, neoplasias e anomalias de desenvolvimento não se regeneram espontaneamente, representando um problema atual na medicina e odontologia.

    Um dos principais fatores que atua impedindo a regeneração é a rápida formação de tecido conjuntivo de origem não óssea, que invade a área do defeito, dificultando ou impedindo parcial ou totalmente a neoformação óssea no local (Frame, 1980; Schimtz & Hollinger, 1986).

    Vários procedimentos cirurgicos têm sido desenvolvidos para o tratamento desse tipo de defeito. O mais comum é o enxerto ósseo autógeno, por apresentar características mais favoráveis a formação de novo tecido ósseo (Schwarz et al., 1991; Isaksson et al., 1992 Assef e Schroder, 1998), mas que exibe vários inconvenientes como: tamanho da área doadora limitada, risco de infecção na área doadora, intensa reabsorção, incorporação do material durante o processo de cicatrização e principalmente, no caso de crianças portadoras de grandes defeitos ósseos a necessidade de uma segunda intervenção cirurgica para obtenção do enxerto, aumenta o tempo de cirurgia e o risco de mortalidade (Coklin, 1971; Younger & Chapman, 1989).

    Baseado na descoberta pioneira de URIST (1965) de que a matriz orgânica óssea possui inúmeros fatores morfogenéticos de natureza protéica com alta capacidade de indução da osteogênese e que posteriormente foram designadas de proteína morfogenética óssea ("BMP"), criou-se uma nova alternativa de tratamento de lesões ósseas perenes, que é a da utilização de matriz óssea alogênica humana preparada por procedimentos especiais para a eliminação de antígenos matriciais (Mulliken et aI., 1981). A matriz liberaria fatores osteoindutores na zona do reparo ósseo favorecendo a diferenciação de células ósseas e a ocorrência da osteogênese. Devido a sua capacidade osteoindutora aliada ao fato de ser facilmente preparada e estocada, a matriz óssea desmineralizada alogênica, obtida de bancos de ossos, exenogênica, de origem bovina, tem sido consideradas excelentes materiais de enxerto ósseo principalmente na área de cirurgias periodontais ou associadas a implantes osteointegrados.

    Uma outra altemativa de tratamento seria aquela que se baseia no princípio da regeneração óssea guiada, utilizando-se de uma membrana biológica de material inerte sobre a região da lesão, isolando e impedindo a invasão da área por tecido conjuntivo de origem não óssea, favorecendo com isso a ocorrência de neoformação óssea na região (Dahlin,Alberius & Linde, 1991; Dahlin, 1994; Matzen, Kostopoulos & Karring, 1996; Mooney et al., 1996; Aaboe, et al., 1998; Lekovic et al.; 1998). Vários tipos de membrana têm sido empregados nessas cirurgias, como a de politetrafluoretileno (e-PTFE), de colágeno, de cortical óssea humana, de polilático, de poliglático e mais recentemente a de cortical óssea bovinà.

    No presente trabalho, avaliamos radiográfica e histologicamente, o desempenho da membrana absorvível de cortical óssea bovina (Gen-derm) associada ou não a matriz óssea bovina (Gen-ox), no favorecimento da ocorrência de regeneração óssea em lesões ósseas perenes criadas em calvária de cobaias.

Material e Métodos
    No atual trabalho foram utilizados 37 cobaias (Cavia porcellus), machos com peso médio de 600g, fomecidos pelo Biotério Central da Faculdade de Odontologiade Bauru -FOB-USP. Todos os animais foram alimentados com ração granulada da marca Purina, capim e água à vontade, durante todo o experimento.

    Os animais foram divididos em dois grupos de 15 animais cada, subdivididos em três subgrupos de cinco animais cada, um grupo controle com cinco e um grupo 0 hora com dois animais.

    Cada grupo correspondeu ao seguinte tratamento do defeito ósseo de tamanho crítico criado cirurgicamente na calvária dos animais:

    1° Grupo - lesão preenchida com coágulo sanguíneo do próprio animal e recoberta com membrana de cortical óssea bovina liofilizada (Gen-derm da Baumer S.A. -Divisão Biomateriais).
    2° Grupo -lesão preenchida com matriz óssea bovina liofilizada em forma de partículas (Gen-ox da Baumer S.A. -Divisão Biomateriais), aglutinada e homogeneizada com coágulo sanguíneo do próprio animal, sendo recoberta com membrana de cortical óssea bovina liofilizada (Gen-derm).
    Controle - lesão preenchida com coágulo sanguíneo do próprio animal.
    Grupo 0 hora -lesão preenchida com coágulo sanguíneo do próprio animal.

Procedimentos cirúrgicos
    As cirurgias foram realizadas com animais sob anestesia geral obtida com injeção intraperitonial, de cloridrato de cetamina (Ketalar injetável -Ache Laboratórios Farmacêuticos S.A) na dosagem de 75mg/kg de massa corporal e Rompun (Bayer-SA), relaxante muscular e sedativo de uso animal na dosagem de l ,5mg/kg. Após tricotomia da região fronto-parietal da cabeça do animal, assepsia vigorosa com iodofor alcoólico e anestesia infiltrativa local com xilocaína a 2% contendo norepinefrina 1:50.000 (Merrell Lepetit Farmacêutica e Industrial Ltda), realizamos uma incisão em formato de meia-lua com bisturi nº 10, no tegumento de revestimento do crânio. Em seguida, com o auxílio de um destaca periósteo e um cinzel, levantamos o retalho lateralmente expondo a superfície óssea da região (Fig. 1a). À seguir com a trefina cirúrgica de I0rnm de diâmetro e irrigação abundante e continua com solução fisiológica, fizemos uma perfuração de 12mm de diâmetro na região fronto-parietal , traspassando toda espessura do diplõe e expondo as meninges no fundo da lesão (Fig. 1b). A seguir preenchemos a lesão conforme o grupo de tratamento (Figs. 1c, d, e e f) e recolocamos o retalho em sua posição suturando-o com linha de seda preta nº 3-0 (Ethicon -Johnson & Johnson) (Fig. 1g).

Sacrifício dos animais, processamento histológico e obtenção das imagens radiográficas
    Os animais dos grupos experimentais foram sacrificados, respectivamente, 1, 3 e 6 meses após as cirurgias, os do grupo controle aos 6 meses pós-cirurgia e os do grupo 0 hora logo após a cirurgia. Imediatamente as suas calotas cranianas foram retiradas com pele sobreposta e fixadas em formol à 10% em tampão fosfato, pH 7,2 durante 7 dias. Após esse período foram obtidas radiografias digitalizadas das calotas utilizando-se de Sistema Digora (Soredex Orion Corporation), sendo que as placas ópticas foram expostas, com os seguintes parâmetros de exposição: 70 kVp, I0mAs, distância foco-filme de 40cm e tempo de exposição 0,26 s.

    Em seguida, as peças foram submetidas a descalcificação em líquido de MORSE (ácido formico à 50% + citrato de sódio à 10%, 1: 1 ), por um período de 30 dias. Após processamento histológico estandardizado, as peças foram incluídas em Histosec (parafina + resina sintética), sendo orientadas para obtenção de cortes histológicos no sentido latero-Iateral. Cortes semi-seriados de 5µm de espessura foram obtidos e corados pela técnica da Hematoxilina- Eosina (HE).

Determinação da área da lesão preenchida por tecido ósseo
    A área da lesão preenchida por tecido ósseo neoformado (A vi) foi determinada para cada período pós-cirurgia, a partir das imagens radiográficas transferidas para um sistema de análise de imagem digitalizada, composto por um software Kontron KS300 (Kontron Electronic GMBM) instalado em um computador IBM. Determinamos a área inicial da lesão (Ai) no grupo de 0 hora e, nos demais grupos, determinamos a área da lesão em que não houve formação de tecido ósseo (A). A área da lesão preenchida por tecido ósseo neoformado (A vi) para cada animal foi calculada pela relação A vi = Ai -A.

    Os dados obtidos para os grupos controle e experimental foram confrontados entre si, pela análise de variância (ANOVA) em nível de probabilidade de erro de 5%.

Resultados
    No atual trabalho, o acompanhamento pós-cirúrgico dos animais mostrou que nenhum deles exibiu sinais externos de ocorrência de infecção na região cirúrgica. Alguns animais mostraram edema, que desapareceu poucos dias depois, sem ocorrência de supuração e abertura da incisão.

1° Grupo - lesão preenchida com coágulo sanguíneo e recoberta com membrana biológica de cortical óssea bovina (Gen-derm).

    No período de um mês pós-cirurgia, a membrana mostrou-se quase que totalmente reabsorvida exceto em dois casos em que a mesma apresentou intensa basofilia e sinais de reabsorção (Fig. 2a); os espaços dos canais nutritivos mostrou-se invadidos por tecido conjuntivo ricamente vascularizado e celularizado, oriundo da superfície periostal externa (Fig. 2b ). Na maioria dos casos, a membrana exibiu reabsorção por células mononucleadas (Fig. 2c). Em apenas um dos casos apresentou células gigantes em algumas partes fragmentadas da membrana. Todos os casos exibiram formação de tecido ósseo trabecular na borda da lesão (Fig. 2a) e o seu espaço mostrou-se preenchido por tecido de conjuntivo ricamente celularizado e vascularizado (Fig. 2c).

    No período de três meses pós-cirurgia, a membrana apresentou em alguns casos quase que totalmente reabsorvida estando representada por pequenos fragmentos no periósteo em reorganização (Fig. 2d e e ) e, às vezes, fragmentos de membrana apresentaram-se inclusos no tecido ósseo neoformado e já com sinais de reabsorção (Fig. 2f). Houve neoformação óssea na borda da lesão (Fig. 2d) e o seu interior apresentou-se preenchido por tecido conjuntivo semelhante ao da superfície superior da membrana. Em apenas um caso, a membrana mostrou-se parcialmente reabsorvida, recobrindo toda a superfície da lesão.

    No período de seis meses pós-cirurgia, a membrana apresentou-se totalmente ausente e em apenas dois casos exibiu pequenos fragmentos da membrana no tecido conjuntivo que recobria a lesão (Fig. 2g). A borda da lesão apresentou grande quantidade de tecido ósseo neoformado já tendendo a um arranjo compacto e, em um dos casos, esse osso neoformado quase que provocou o fechamento da lesão ficando apenas uma pequena abertura no centro ocupada por tecido conjuntivo denso.  

2° Grupo - lesão preenchida com matriz óssea bovina liofilizada em partículas (Gen-ox) e recoberta com membrana biológica de cortical óssea bovina (Gen-derm).

   No período de um mês pós-cirurgia a membrana, apresentou-se na maioria dos casos íntegra (Fig. 3a) e com os espaços referentes aos antigos canais nutritivos, preenchidos por tecido conjuntivo. Apenas em um dos casos exibiu reabsorção interna ao redor dos espaços invadidos pelo tecido conjuntivo. Todos os casos mostraram pequena formação de tecido ósseo na borda da lesão e o espaço do defeito apresentou-se preenchido por tecido de granulação entremeado a partículas de matriz óssea liofilizada em diterentes fases do processo de reabsorção por células mononucleadas (Fig.3a).

    No período de 3 meses pós-cirurgia, a membrana apresentou-se na maioria dos casos totalmente reabsorvida. Em apenas um caso, a membrana mostrou-se quase que íntegra e aderida a sua superfície, exibia pequena quantidade de tecido ósseo neoformado (Fig. 3b ). Em todos os casos, a borda da lesão exibia intensa neoformação óssea e no seu interior fragmentos de matriz óssea liofilizada em processo de reabsorção (Fig. 3c e d), continha tecido ósseo neoformado associado tormando pequenas ilhas ósseas (Fig. 3c e d).

    No período de seis meses pós-cirurgia, a membrana apresentou-se, em dois casos, totalmente ausente e em três casos, pequenos fragmentos de membrana no periósteo reorganizado (Fig. 3g). Associado a borda da lesão, havia grande quantidade de tecido ósseo neoformado já tendendo a um arranjo compacto e em dois casos, quase que o fechamento total da lesão (Fig. 3g). O espaço remanescente do defeito mostrou-se preenchido por tecido conjuntivo denso, exibindo no seu interior, fragmentos de matriz óssea liofilizada em reabsorção e pequenas ilhas de tecido ósseo neoformado (Fig. 3e e f).

Grupo controle - lesão preenchida com coágulo sanguíneo do próprio animal.

    No período de seis meses pós-cirurgia, em todos os animais da amostra, a borda da lesão apresentou menor quantidade de tecido ósseo neoformado do que nos grupos experimentais e o espaço da lesão preenchido por tecido conjuntivo denso (Fig. 4a). Em um dos animais, o tecido conjuntivo exibiu uma pequena ilhota de tecido ósseo na área central da lesão.

Análise Rediogrática e Morfológica

    A análise dos resultados radiográfico e morfométrico apresentados nas Figuras 5a, b, c, e d e no Gráfico I, mostrou que:
    A lesão preenchida com coágulo sanguíneo e recoberta com membrana no período de 1 mês pós cirurgia, apresentou formação de 14,4mm de tecido ósseo na sua borda em relação ao controle 0 hora (Fig. 5a). Após 6 meses (Fig. 5b) observou-se a formação de cerca de 32,9mm de novo tecido ósseo, levando a um fechamento da lesão em 51,73% a partir da sua borda, em relação ao período inicial de 0 horas (compare as Figs. 5a e b).

    A lesão preenchida com matriz +coágulo sanguíneo e recoberta com a membrana no período de 1 mês pós-cirurgia, apresentou formação de 11,8mm de tecido ósseo em relação ao controle 0 hora (Fig. 5a) a partir da borda. Após 6 meses (Fig. 5e) observou-se a formação de cerca de 39,4mm de novo tecido ósseo, levando a um fechamento da lesão em 61,9%. Este fechamento significativo da lesão ocorreu devido a formação no seu interior de inúmeras granulaçães radiopacas que indicaram a formação de ilhotas ósseas que fusionavam entre si, como já descrito nos resultados mortológicos (Fig. 5e), e por menor formação óssea a partir da borda da lesão.

     O grupo controle preenchido somente com coágulo sanguíneo e não recoberta com membrana, apresentou ao final de 6 meses (Fig. 5d) uma formação óssea de 29,2mm , que toi estatisticamente menor (P<0,05) em relação as lesões preenchidas com matriz +coágulo e recoberto com membrana.

 Discussão
    Desde o surgimento da técnica da regeneração tecidual guiada no início da década de 90, muitas membranas foram desenvolvidas e aperfeiçoadas para serem utilizadas como barreira física. A mais conhecida e pesquisada e que tem apresentado bons resultados no tratamento de vários tipos de defeitos ósseos, é a membrana de politetrafluoretileno expandido ou e-PTFE (Dahlin et al., 1988, 1989, 1990; Becker et al., 1990, 1991 ;Caudill & Meffert, 1991 ;Dahlin, 1993; Melloning & Triplett, 1993; Fritz et al., 1994; Schenk et aI.,1994; Hammerle et al., 1995; Pecora et al.,1995;Piette et al., 1995; Gordh et al.,1998; Ito, Nanba & Murai, 1998; Kohal, I998). No entanto, como está constituído de material não bioreabsorvível, tem um sério inconveniente que é a necessidade de submeter o paciente a urna segunda intervenção cirúrgica para a sua remoção.

    No sentido de eliminar a cirurgia de reentrada, reduzir a morbidade geral do tratamento e dar maior conforto ao paciente, vários laboratórios lançaram no mercado de material cirúrgico, membranas bio-reabsorvíveis, como a de cortical de femur humano, de colágeno bovino, de ácido polilático, de ácido poliglático, etc. Inúmeras pesquisas desenvolvidas com a utilização dessas membranas em vários tipos de defeitos ósseos e de tratamentos têm mostrado resultados satisfatórios (Schults &Gager, 1990; Crigger et al.,1996; Mooney et al.,1996; Schmid et al.,1997; Lekovic et aI.,1998).

    No atual trabalho utilizamos como barreira fisica no tratamento de lesões ósseas perene uma nova membrana absorvível de cortical óssea bovina liofilizada (Gen-derm da Baumer),que está sendo introduzida no mercado brasileiro.

    O tratamento convencional de regeneração óssea guiada, ou seja, as lesões preenchidas com coágulo sanguíneo e recobertas com membrana, apresentou ao final de 6 meses pós-cirurgia em média cerca de 52% da área da lesão preenchida por tecido ósseo de arranjo compacto, o restante 48% apresentava-se preenchido por um tecido conjuntivo fibroso. Embora neste caso, a neoformação tenha sido superior ao do grupo controle que foi em média de 46%, esta diferença não foi estatisticamente significante, devido a grande variação ocorrida dentro do grupo experimental, provavelmente causada pelo colápso local da membrana ocorrido em alguns animais. Este colápso foi decorrente da membrana em estudo não apresentar uma estrutura fisica capaz de suportar pressões externas e, como o coágulo que preenchia inicialmente a lesão é rapidamente reabsorvido, a membrana invaginou para o interior da lesão, reduzindo o seu espaço. A criação e a manutenção de um espaço geométrico adequado são fatores importantes para que haja a regeneração óssea (Sandberg, Dahlin & Linde, 1993; Dahlin, 1994; Aaboe et al., 1998; Naaman & Ouhayoun, 1998; Wiltfang, Merten & Peters, 1998, Ito, Nanba & Murai, 1998). Por isso, no caso de defeitos ósseos extensos tem-se indicado, para a manutenção do espaço, a utilização de membrana PTFE reforçada com malha de titânio, ou de material ósseo substituto de preenchimento para sustentação de membrana absorvível.

    A utilização de enxertos ósseos desmineralizados já vem sendo estudado a mais de um século (Senn,1889; Urist, I 965; Glass,1989; Vanderteenhoven & Spector, 1983; Hurzeler et aI., 1997) e vários destes estudos levaram ao sucesso na utilização de matriz óssea alogênica desmineralizada em humanos portadores de deformidades cranio-maxilo-facial (Mulliken et al., 1981; Glowacki et al., 1981; Glowacki and Mulliken, 1985; Rummelhart, 1989: La Fontaine & Pinto, 1997), porém alguns autores tem questionado quanto a predicabilidade desta matriz em induzir a neoformação óssea (Nishibori et aI. , 1994; Becker etal., 1994, 1995 aeb; Xiao,et al.,1996).Nestes casos, recentes trabalhos tem demonstrado que a capacidade osteoindutiva da matriz óssea desmineralizada humana varia de acordo com a idade, a fisiologia e as condições farmacológicas do doador, como também das possíveis variações relacionadas ao protocolo de processamento e esterilização utilizados nos diferentes bancos de ossos (Zang, Power & Wolfinbarger, 1997 aeb; Schwartz et al., 1996 e 1998). Para esses autores fica claro a necessidade de testes biológicos para avaliar a capacidade indutora da matriz óssea desrnineralizada antes da sua comercialização.

    Aliado a estes fatores, existe a questão ética quanto a comercialização de ossos humanos e a crescente preocupação quanto aos possíveis riscos de contaminação pelo vírus da AIDS e da hepatite (Buck, 1990; Marx & Carlson, 1993; Marty & Richter, 1998) por isso, foram lançados no mercado produtos com as mesmas finalidades, originados de osso bovino, que tem sido utilizado com sucesso na odontologia (Mulatinho e Taga, 1996). Para Rosenthal, Folkman e Glowacki( 1999) a matriz óssea desmineralizada xenogênica de origem bovina apresenta resultados semelhantes ao da matriz alogênica e inúmeras vantagens no tratamento de fraturas ósseas, cistos ósseos e lesões ósseas fribrosa.

    Em nosso trabalho, no outro grupo experimental, os defeitos ósseos toram preenchidos com matriz óssea bovina desmineralizada em partículas aglutinada com coágulo sanguíneo e recobertos com a membrana de cortical óssea bovina liofilizada. Ao final de 3 meses pós-cirurgia foi observado um aumento em média de apenas 36% de tecido ósseo neoformado. Nesse caso, a neoformação óssea foi menor na borda devido provavelmente, ao fato da lesão estar ainda preenchida em grande parte por matriz bovina em reabsorção, dificultando o crescimento ósseo pela borda. Porém, entre 3 e 6 meses, houve um aumento significativo de tecido ósseo neoformado, chegando ao final do período em média com 62% da lesão preenchida por novo tecido ósseo principalmente em forma de ilhas dispersas num conjuntivo ricamente celularizado ou em alguns casos, essas ilhas ósseas estavam fusionadas promovendo quase o fechamento do espaço da lesão. Neste caso, provavelmente o enxerto de matriz óssea bovina desmineralizada atuou como um material osteoindutor, como sugerido por Glass, Melloning & Towle, (1989) liberando proteínas morfogenéticas ósseas aprisionadas no seu interior durante a sua reabsorção por células mononucleadas. Essas proteínas, por sua vez, induziriam a ocorrência de vários eventos em cascatas, tais como: quimiotaxia, proliferação e diferenciação das células mesenquimais indiferenciadas em células osteoprogenitoras, angiogênese, diferenciação de osteoblastos, síntese de matriz extracelulàr e formação de novo tecido ósseo (Heckman et al. , 1991 ; Yasko et al., 1992; Wolte & Cook, 1994; Ripamont et al., 19%).

    Porém, no atual experimento, esse tipo de tratamento não provocou em nenhum animal fechamento completo da lesão. No entanto, Taga et al. (1997a) obtiveram fechamento total de defeitos ósseos de 8mm de diâmetro em calvária de cobaias tratados somente com a matriz óssea bovina liofilizada. Esta aparente contradição poderia estar ligada ao tamanho significativamente maior do defeito (12mm) utilizado na atual pesquisa ou a membrana ter dificultado a reabsorção do enxerto e atrasado a osteogênese. Estudo realizado por Dahlin (1993) em mandíbulas de ratos, demonstrou que a colocação da membrana atrasa o início da neo formação óssea e de mineralização, porém este atraso é compensado pelo aumento contínuo e prolongado de formação e mineralização de novo tecido ósseo em períodos subsequentes. Portanto, em nosso caso, talvez o fechamento completo pudesse ter ocorrido se alongássemos o período experimental para que todo enxerto pudesse ser reabsorvido e a formação óssea completada;

    Outro fato importante e que também pode ter desfavorecido a neoformação óssea, foi o fato da lesão ter sido recoberta apenas na sua superfície voltada para a derme, enquanto que a superfície voltada para a duramater ficou exposta, o que pode ter permitido a invasão da lesão por tecido conjuntivo oriundo desta região. Neste sentido, salientamos que Bosch, Melsen & Vargervic, (1995) utilizaram em sua pesquisa na calvária de ratos, dupla membrana de ePTFE, uma na abertura tegumentar e outra na abertura epidural da lesão, sendo a última para evitar a migração celular oriunda da duramater, obtendo nesse caso uma regeneração óssea maior do que a do grupo com uma única membrana.

    Mais recentemente, Taga et al.(2000) tratando o mesmo tipo de deteito ósseo em ca!vária de cobaias, com a mistura de matriz óssea bovina desmineralizada e hidroxiapatita ultrafina recoberta por membrana de cortical óssea bovina liofilizada, obtiveram o fechamento de 73,3% da área do defeito por tecido ósseo neoformado.

    A reabsorção da membrana, em ambos os tratamentos, ocorreu pela atividade de células mononucleadas, semelhantes a fibroblastos que invadem o interior da membrana através das suas porosidades. Estudo realizado por Taga et al. ( I 997b ), mostrou que a reabsorção desse tipo de membrana quando colocada na superfície desnuda de calvária de cobaias, ocorriam na seguinte sequência: formação de tecido conjuntivo denso recobrindo a membrana; invasão dos espaços correspondentes aos canais nutritivos por células mononucleadas e vasos sanguíneos; destruição inicial das porções correspondentes as lamelas intermediárias; ocupação dos espaços formados por novas células mononucleadas; destruição das lamelas de Havers; e substituição do espaço da membrana por tecido conjuntivo.

     Em alguns casos, foi observado a presença de pequenos focos de neoformação óssea na superfície da membrana voltada para o espaço da lesão, indicando que durante a sua reabsorção possa ter havido liberação de proteínas osteoindutoras, sabidamente existentes na matriz orgânica óssea (Urist, 1965; Yasko et al., 1992; Alper, 1994; Schenk, 1994; Wolfe & Cook, 1994). Este fato pode ter acontecido, porque a produção desse tipo de membrana pelo fabricante, segue o mesmo protocolo utilizado para o preparo da matriz bovina liofilizada em partículas.

    Outro fato que deve ser salientado foi a quase total ausência de infiltrado linfocitário associado a membrana e a matriz óssea bovina desmineralizada na maioria dos animais, sugerindo que estes materiais apresentam um caráter antigênico muito baixo na cobaia, fato este, que já havia sido observado em pesquisas anteriores (Taga et al. 1997a e b).

Conclusão
    A partir dos resultados obtidos podemos inferir que: a) a membrana de cortical óssea bovina liofilizada não apresenta estrutura física capaz de suportar pressões externas. Por isso, em lesões extensas ocorre o colápso da membrana, sendo necessário nestes casos, a utilização de parafusos ou cola cirúrgica para fixação da membrana ou de material ósseo substituto de preenchimento para sua sustentação; b) os enxertos ósseos de matriz óssea bovina desmineralizada em partículas sofrem reabsorção e promovem a formação de ilhas de osso no interior da lesão e c) o enxerto de matriz óssea bovina associado a membrana auxilia na manutenção do espaço da lesão evitando o colápso da membrana e, com isso, leva a aumento do efeito osteogênico na região, podendo ser uma alternativa no tratamento de lesões ósseas perenes de menor tamanho na boca.

       

       

FIGURA 1.- Procedimentos cirúrgicos:
a) incisão em formato de meia lua e exposição da superfície óssea na região fronto parietal;
b) lesão óssea realizada;
c) trefina cirúrgica utilizada, membrana de cortical óssea bovina (Gen-derm) e matriz óssea bovina desmineralizada em partículas(Gen-ox);
d) preenchimento do defeito com coágulo sanguíneo;
e) preenchimento do defeito com a matriz óssea(Gen-ox) e coágulo sanguíneo;
f) recobrimento do defeito com a membrana de cortical óssea(Gen-derm); e
g) sutura realizada.

       
       

FIGURA 2.- Lesão preenchida com coágulo sanguíneo e recoberta com membrana. Período de I mês:
a) Observar membrana quase íntegra(seta preta), neoformação óssea (ON) na borda da lesão (BL) e o preenchimento da lesão por tecido conjuntivo, HE, I3x;
b) detalhe do preenchimentos dos espaços da membrana por tecido conjuntivo (setas pretas), HE, 32x e
c) reabsorção da membrana por células mononucleadas(setas pretas) e a região da lesão preenchida por tecido conjuntivo ricamente vascularizado(setas brancas), HE; 32x. Período de 3 meses:
d) Intensa neoformação óssea(ON) na borda da lesão(BL) e fragmentos de membrana (setas pretas) na superfície óssea neoformada, HE, I3x;
e) detalhe da superfície óssea neoformada (ON), dos fragmentos de membrana(setas pretas) e do aprisionamento de parte destes fragmentos no tecido ósseo neoformado, HE, 32x e
f) detalhe da membrana (setas pretas) aprisionada no tecido ósseo (setas brancas), HE, BOx. Período de 6 meses:
g) Observar fragmentos de membrana (setas pretas) na superfície periostal e a intensa formação óssea, na borda da lesão (BL) já tendendo para um arranjo compacto, HE, 32x.

        
      

FIGURA 3.- Lesão preenchida com matriz óssea bovina desmineralizada e coágulo sanguíneo e recoberta com membrana. Período de I mês:
a) Observar membrana íntegra (seta branca), o espaço da lesão preenchido por tecido conjuntivo ricamente celularizado (asterisco) e matriz em reabsorção (seta preta), HE, I3X. Período de 3 meses:
b) Observar membrana parcialmente reabsorvido e pequena neoformação óssea (seta branca) na sua superfície voltada para a lesão., HE, 80x;
c) detalhe da matriz óssea (setas pretas) em reabsorção apresentando intensa basofilia e pequena ilha de neoformação óssea (seta branca) associada a matriz, HE, 80x. e
d) estágio mais avançado de reabsorção da matriz (setas pretas) e de neoformação óssea (setas brancas), " HE, 80x. Período de 6 meses:
e) Observar pequena quantidade de matriz ainda em reabsorção (setas pretas), ilhas de tecido ósseo neoformado (setas brancas) ainda separados por grande quantidade de tecido conjuntivo (asteriscos), HE, 32x;
f) neste caso, presença de grandes ilhas ósseas (setas brancas) separadas por filetes de tecido conjuntivo (asterisco), HE, 32x; e
g) neste outro caso, restos da membrana (setas pretas) no periósteo, grande quantidade de tecido ósseo neoformado (ON) ainda em reorgnização e quase o fechamento total da lesão na região (asterisco), HE, 13x.

 

FIGURA 4: Controle 6 meses, lesão preenchida apenas com coágulo sanguíneo.
a) Observar pequena neoformação óssea (ON) na borda da lesão (BL) e o preenchimento da lesão por tecido conjuntivo denso (asterisco), HE, 13x.

         

FIGURA 5: Imagens radiográficas:
a) a lesão inicial;
b) lesão preenchida com coágulo sanguíneo e recoberta com a membrana (Gen-derm) 6 meses pós-cirurgia, observar grande aumento de tecido ósseo na borda da lesão;
c) lesão preenchida com matriz óssea (Gen-ox) e coágulo sanguíneo e recoberta com membrana (Gen-derm) 6 meses pós-cirurgia, observar a formação de inúmeras granulações radiopacas no interior da lesão, referentes as ilhas ósseas observadas na análise morfológica; e
d) Controle 6 meses, observar pequena diminuição do defeito a partir da sua borda.

Referências Bibliográficas CORRIGIR

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