Avaliação
morfológica de osteoblastos humanos
cultivados sobre titânio puro e
titânio recoberto com hidroxiapatita
M.H.
Prado da Silva, J.H.C.Lima; G.D.A. SOARES, C.N. ELIAS,
H. Schechtman, S.M. BEST, I.R. Gibson, L. DISILVIO, M. DALBY,
Introdução
O processo de formação
de osso novo é complexo e envolve a interação de uma grande variedade de células
e condições de superfícies. As células osteogênicas são os osteoblastos e os
condroblastos. Uma medida da capacidade osteoindutora dos materiais bioativos
é a diferenciação de células precursoras nessas células (OHGUSHI et al.,
1996B). Vários fatores locais ajudam a determinar a diferenciação
das células precursoras dos osteoblastos. O tipo de rugosidade também determinará
o número e tipos de ancoragens focais das células com seu substrato. Observa-se
que em supefícies rugosas, as células formam camadas que cobrem os vales entre
os picos (BOYAN et al., 1996). Estudos recentes indicam a importância
da caracterização metalúrgica e biológica de superfícies de biomateriais (DA
SILVA et al, 1998A; DA SILVA et al, 1998B; PRADO DA SILVA, 1999).
As
interações entre as células e os biomateriais é favorecida pela absorção de
proteínas às superfícies. Os recobrimentos com fosfatos de cálcio têm a vantagem
de facilitar esse processo de absorção. Dentre os fosfatos de cálcio, a hidroxiapatita
(Ca/P=1,67) é o que tem maior capacidade de adsorver proteínas a sua superfície
(TAKASHIMA et al.,. 1996).
No presente trabalho,
osteoblastos humanos foram cultivados sobre quatro diferentes substratos metálicos:
três placas de titânio comercialmente puro com diferentes níveis de rugosidade
e uma placa de titânio comercialmente puro recoberta com hidroxiapatita. Os
substratos foram primeiramente observados em microscopia eletrônica de varredura.
Os testes de cultura de células indicaram uma melhor
resposta celular ao substrato recoberto com hidroxiapatita.
Palavras-chave
Titânio, hidroxiapatita,
osteoblastos
Keywords
Titanium, hydroxyapatite,
osteoblasts
Resumo
A resposta celular ao
titânio recoberto com hidroxiapatita tem sido estudada por diversos autores.
O método mais utilizado para investigação da morfologia celular in vitro
tem sido a microscopia eletrônica de varredura (MEV). É reconhecido que
os implantes recobertos com hidroxiapatita apresentam uma melhor resposta óssea
nos estágios iniciais de recuperação, quando comparados a implantes de titânio
puro não recobertos. No presente estudo, placas de titânio comercialmente
puro com diferentes níveis de rugosidade foram utilizadas como substrato para
cultura de osteoblastos humanos em comparação com placas recobertas com hidroxiapatita.
Observou-se que as placas recobertas com hidroxiapatita apresentaram espraiamento
dos osteoblastos, além de inúmeros processos citoplasmáticos quando comparadas
a placas de titânio puro.
Abstract
Cell
response to titanium coated with hydroxyapatite has been studied by several
authors. The most used method for in vitro investigation of cell morphology
is scanning electron microscopy (SEM). Hydroxyapatite coated implants are known
to show a better bone response in the early stage of healing, when compared
to uncoated implants. In the present paper, commercially pure titanium plates
with different surface roughness levels were used as substrates tor human osteoblasts
culture in comparison to hydroxyapatite coated plates. It was observed that
the hydroxyapatite coated plates showed osteoblasts spreading with many cytoplasmatic
processes when compared to uncoated plates. .,
Materiais e métodos
Foram estudadas quatro diferentes
superfícies: amostras usinadas, amostras jateadas com alumina, amostras recobertas
com titânio por aspersão térmica a plasma e amostras recobertas com hidroxiapatita
por um processo eletrolítico.
Foram utilizadas amostras
de 10x 10x 1 mm para este estudo. Uma amostra de cada condição foi utilizada
para análise da morfologia das superfícies e análise química semi-quantitativa
por energia dispersiva (EDS) em MEV. Duas amostras de cada condição que foram
utilizadas para os testes de cultura de células.: As chapas foram limpas em
acetona em banho ultra-sônico e esterilizadas sob irradiação de Raios-Gama com
uma dose de 27,4 KiloGray.
Os osteoblastos humanos foram cultivados
em frascos de cultura estéreis Falcon de 75cm2 e 15Ocm2 a 37°C em uma atmosfera
umidificada com fluxo de 5% CO2. Utilizou-se como meio de cultura o MEIO
DE EAGLE MODIFICADO POR DULBECCO (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino
(FCS), 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA), ácido L-ascórbico (150gml-l),
L-glutamina (0,02M), C5 H10 N2O3 (HEPES) em solução 0,01M, 100 unidades mI-l
de penicilina e 100 mg mI-l de estreptomicina, como descrito no Apêndice I.
A exceção do ácido L-ascórbico suprido por Sigma (Poole, UK), todos os outros
componentes foram supridos por Gibco (Paisley, UK).
Após atingirem confluência, as células foram coletadas
seguindo-se o procedimento de tripsinização descrito no Apêndice I. A suspensão
de células foi recentrifugada a 683 rpm por 5 minutos e o aglomerado de células
foi resuspensa em DMEM utilizando-se uma seringa para quebrar os aglomerados
de células. A suspensão original de células foi diluída para alcançar a densidade
requerida. A suspensão obtida foi passada por uma pipeta Pasteur para garantir
uma dispersão homogênea de células no meio antes de semeá-las nos substratos.
As placas foram posicionadas nos poços dos frascos multi-well
estéreis Falcon e semeadas com uma densidade de aproximadamente lxl0 6 células
ml-l, sendo que aproximadamente 50ml da suspensão foram semeados sobre cada
amostra. A suspensão foi deixada repousar sobre cada amostra durante 60 minutos
antes de completar o volume de cada poço com DMEM. Durante esse tempo, permitiu-se
que as células aderissem às superfícies sobre as quais foram semeadas. As culturas
foram encubadas durante 2 dias. O meio de cultura foi apropriadamente trocado
em intervalos de dois ou três dias. Os frascos multi-well foram separados de
acordo com a finalidade da cultura e do ponto de tempo utilizado.
As análises topográficas em MEV
revelaram que a amostra usinada apresentou a superfície livre de rebarbas provenientes
do processo de usinagem.
Na amostra recoberta com alumina, foram observadas algumas partículas, identificadas
em EDS como sendo partículas de alumina, provenientes do processo de jateamento.
A amostra jateada com pó de titânio apresentou uma superfície bastante rugosa,
porém homogênea e aparentemente bem aderida ao substrato. A amostra recoberta
com titânio por aspersão térmica e plasma revelou uma superfície rugosa, totalmente
recoberta por cristais de hidroxiapatita.
A Figura 1 apresenta um difratograma de EDS da amostra jateada com alumina, onde pode-se observar o pico correspondente ao elemento alumínio.
As Figuras 2a-2d apresentam os resultados de observação em
MEV das células cultivadas sobre os diferentes substratos.
Figura 1 - Morfologia dos osteoblastos cultivados durante
2 dias: (a) amostra usinada; (b) amostra jateada com alumina; (c) amostra recoberta
com titânio por aspersão térmica a plasma; (d) amostra recoberta com hidroxiapatita
pelo processo eletrolítico.
A superfície usinada apresentou camadas
de células e células esfereoidizadas em fase de divisão celular. A amostra recoberta
com alumina apresentou células bastante esferoidizadas e pouco sinal de espraiamento
celular. Esse resultado indica uma superfície imprópria para a adaptação das
células, resultado esse que pode ser atribuído à presença de partículas de alumina
presentes nessa condição de superfície. A amostra recoberta com titânio por
aspersão térmica a plasma apresentou uma resposta celular muito boa, com células
bastante espraiadas. Observou-se que a superfície recoberta com hidroxiapatita
apresentou os osteoblastos mais espraiados e com o maior número de processos
celulares se projetando para a superfície. Esse fato indica uma melhor ancoragem
dos osteoblastos a essa superfície.
Conclusões
A análise em EDS detectou a presença de partículas de
alumina na amostra jateada. Esse resultado indica a importância dos tratamentos
de limpeza e descontaminação de superfícies potencialmente utilizadas como implantes,
como ressaltado por diversos autores.
A observação em MEV se mostrou eficiente na avaliação
da morfologia
dos osteoblastos humanos.
A superfície recoberta com hidroxiapatita apresentou os osteoblastos
mais espraiados dentre todas as condições de superfície analisadas.
Na amostra recoberta com hidroxiapatita, foram identificados
inúmeros processos celulares se projetando para os cristais de hidroxiapatita,
fato que indica uma boa adesão dessas células a esta superfície.
Referências Bibliográficas