Destino
de membrana de cortical óssea bovina colocada em posição
subperióstica na calvária de cobaia
R. Taga*, C.Y. Hassunum**, T.M. Cestarii*** e P. M. Ferreira****
RESUMO
Na
atual pesquisa avaliamos o destino de membranas biológicas de cortical óssea
bovina colocadas em posição subperióstica no crânio de cobaias machos adultos.
Utilizamos um total de 12 animais, que foram divididos em 3 grupos de 4 animais.
Em cada animal foi realizada a cirurgia junto a região fronto-parietal do crânio
com a colocação de membrana de cortical óssea bovina sobre a superfície óssea
desnuda. Os crânios de cobaias de cada grupo, foram coletados decorridos 1,
3 e 6 meses após as cirurgias.
Após sofrerem , descalcificação, as peças foram processadas
para inclusão em Paraplast e cortes histológicos frontais semi-seriados de 6
µm de espessura, foram obtidos. A análise histológica dos cortes, mostrou
que a membrana é lentamente reabsorvida da superfície óssea por atividade de
células mononucleadas. Muito raramente observou-se, células multinucleadas em
sua superfície. Em alguns casos, verificou-se junto das faces tegumentar e óssea
da membrana, a formação de fina camada de tecido ósseo, que era em seguida reabsorvida
conjuntamente com a matriz implantada.
UNITERMOS
Membrana de cortical óssea; Matriz óssea liofilizada; Reabsorção
ABSTRACT
In
present histological investigation we evaluated the fate of bovine cortical
bone membranes ( -150µm of thickness) placed at subperiostic site in the
adult Guinea pig skulls. Three groups, with 4 male animals were used; in each
animal was performed a surgical procedure in the fronto-parietal bone region
with placement of bovine cortical bone membrane above denuded calvarial surface.
Skulls of animals of each group, were colected after 1,3 and 6 months and fixed
in neutral phosphate buffered 10% formalin.
After decalcification, the specimens were processed
for Paraplast embedding and frontal histological sections were obtained. Histological
analysis of the sections showed that the membrane is slowly resorbed from the
bone surface by activity of mononucleated cells, very rarely multinucleated
giant cells were seen. In some cases, a fine layer of bone tissue was formed
at the skin and bone surfaces of membrane, and combined with implanted membrane
was also resorbed.
UNITHERMS
Cortical bone membrane; Lypphilized bone matrix; Resorption.
INTRODUÇÃO
Em certas situações, traumas ou doenças infecciosas, podem provocar uma perda excessiva de tecido ósseo em certa região do organismo, determinando o aparecimento de um defeito ósseo perene, ou seja, defeito ósseo que não se regenera espontaneamente.
Várias técnicas cirúrgicas foram desenvolvidas, tanto na área médica, como na odontológica, para o tratamento deste tipo de defeito. Uma grande parte destas técnicas preconizam a utilização de uma membrana de material inerte para recobrir a zona de defeito ósseo, que funcionaria como uma barreira biológica entre os tecidos moles suprajacentes e a região onde deve ocorrer a regeneração óssea, impedindo a migração do epitélio e/ou de tecido conjuntivo para dentro do defeito ósseo, criando com isso, um microambiente propício para a osteogênica.
Assim, no início membranas de acetato de celulose (Millipore) foram utilizadas no reparo de lesões ósseas em corticais de ossos longos (BASSET et al, 1961; RUEDI e BASSET, 1967) e na região buco-facial (BOYNE, 1964 e 1969). À partir desses trabalhos pioneiros, este princípio, designado posteriormente, de regeneração tecidual guiada ("guided tissue regeneration"), foi utilizada em inúmeros estudos de regeneração de diferentes tipos de defeitos ósseos (DAHLIN et al. 1989,1990,1991; BECKER et al, 1990, 1991 e 1992; WARRER et al, 1991 e 1992; LINDE et al, 1993; SCHULTZ e GAGER, 1990; CORTELLINI et a1, 1990; : PAUL et al, 1992; MELLONING e TRIPLETT, 1993; .CALLAN, 1993). Em todos estes estudos, os resultados têm demonstrado grande benefício na regeneração óssea com a utilização da membrana.
Dentre as membranas biológicas as mais utilizadas são as de politetrafluoretileno expandido ou Teflon, conhecidas como membrana PTFEe (Gore-Tex). Este tipo de membrana, como esta constituído de um material não biodegradável, deve ser retirado após a regeneraçao óssea com a realização de uma segunda intervenção cirúrgica.
Como alternativa para evitar esta segunda cirurgia, tem sido lançado no mercado, membranas reabsorvíveis, como a de cortical de fêmur humano (Life Met Tissue Bank Transplant Service), de colágeno bovino (Collistat, Te Kendal Co ), de ácido poliglático (Ethicon, Inc), etc.
Pesquisas têm mostrado que estas membranas, além de funcionarem razoávelmente bem como barreira biológica, são integralmente reabsorvidas pelo organismo (SCHULTZ e GAGER, 1990; CALLAN, 1993; PAUL et al, 1992), eliminando com isso, a necessidade da segunda intervenção cirúrgica, que é crítica neste tipo de procedimento.
Mais recentemente apareceu no mercado uma membrana de cortical óssea bovina (Dentoflex), que segundo o fabricante é uma membrana reabsorvível. Como os clínicos nos têm passado informações sobre o razoável sucesso na utilização desse tipo de membrana, decidimos na presente pesquisa, investigar experimentalmente o destino desta membrana, quando colocada em sítio ortotópico na superfície do crânio de cobaias.
MATERIAL E MÉTODO
O teste biológico do destino de membranas de matriz óssea bovina liofilizada, foi realizada em cobaias ( Cavia porcellus) machos adultos, com massa corporal ao redor de 500g, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Bauru -USP.
Foram utilizados um total de 12 cobaias divididos em 3 grupos de 4 animais cada, conforme os períodos experimentais de 1, 3 e 6 meses, após o enxerto da membrana.
As cirurgias foram realizadas com os animais sob anestesia geral com Nembutal sódico (Abbott Laboratórios do Brasil) na dose de 500mg por kg de massa corporal.
Após anestesia realizamos a tricotomia da região fronto-parietal da cabeça do animal com auxílio de lâmina de barbear e a assepsia vigorosa com iodofor alcoólico. Utilizamos para anestesia infiltrativa local a Xilocaína a 2% com Norepinefrina 1:50,000 (Merrell Lepetit Farmacêutica e Industrial LTDA).
Com o animal devidamente anestesiado, foi feita uma incisão sagital no tegumento de revestimento do crânio, acompanhando a junção dos ossos parientais e penetrando na região do osso frontal (Figura 1a). Com auxílio de um destaca periósteo e um cinzel, expomos a cortical óssea e retiramos cuidadosamente o periósteo da região (Figura 1b). Sobre esta superfície colocamos a membrana de cortical óssea bovina liofilizada (Dentoflex) de dimenssões 1,0 x 2,0 cm, umidecida com solução isotônica de cloreto de sódio a 0,9% (Figuras 1c, 1d e le). Os retalhos foram à seguir recolocados em sua posição e suturados (Figura 1f) com linha de seda preta no3-0 (Ethicon -Johnson & Johnson), que foram retirados após 10 dias de realizada a cirurgia.
Os três grupos de cobaias foram sacrificados, respectivamente, 1, 3 e 6 meses após a cirurgia, e as suas calotas cranianas foram retiradas juntamente com a pele sobreposta e Imediatamente colocadas em solução de formol à 10% em tampão fosfato, onde permaneceram em processo de fixação histológica por 1 semana.
As peças histológicas foram, à seguir, submetidas a descalcificação em solução de ácido fórmico a 50% e citrato de sódio a 20% (1:1), durante aproximadamente 1 mês. Após serem lavados por uma noite em água corrente, as peças sofreram processamento histológico estandardizado de desidratação em soluções de concentração crescente de etanol, diafanização em xilol e inclusão em Paraplast.
Cortes histológicos latero-laterais com 6µm de espessura foram obtidos em micrótomo Multicut-Leica-Jung, e corados pela Hematoxilina-Eosina(H.E.) e Tricrômico de Masson, modificado por Goldner.
RESULTADOS
No presente experimento, todas as cobaias mostraram exelente recuperação nos dias subsequentes a cirurgia, não necessitando em nenhum dos casos de utilização de anti-inflamatórios e/ou antibióticos.
No grupo experimental de 1 mês pós-cirurgia, observa-mos em todos os casos, a membrana ainda íntegra justaposta a superfície da calvária (Figura 2a) ou em um caso, separada desta por uma fina camada de tecido conjuntivo (Figuras 2e e 2f). As bordas laterais da membrana já apresentavam aspecto biselado (Figura 2b ). Em nenhum dos animais, com exceção de um caso que encontra apresentado nas Figuras 2e e 2f, se observou infiltrado linfocitário no tecido conjuntivo fibroso presente na superfície tegumentar óssea do enxerto. Um fato importante observado em todos os casos, foi a invasão dos espaços da membrana, correspondentes aos canais nutritivos ósseos (canais de Havers e Volkmann), por células mononucleadas e vasos sanguíneos (veja cabeças de seta nas Figuras 2c, 2d e 2f). Na Figura 2d (cabeças de seta) observa-mos que alguns espaços já apresentavam superfície com aspecto corroído.
No grupo experimental de 3 meses pós-cirurgia, a membrana em todos os casos, já exibia em estado avançado de reabsorção, com sensível diminuição na sua largura total. O processo de reabsorção, às vezes, ocorria por igual dos dois lados, e em outros casos, predominava em um dos lados (veja na figura 3a como a membrana já desapareceu do lado direito e o processo de reabsorção já está passando para o lado esquerdo - a seta indica a zona de reabsorção e a cabeça de seta a sutura dos ossos parietais). A análise histológica mostrou que a reabsorção ocorria das bordas para a sua porção mediana. Na reabsorção havia dissolução das lamelas ósseas intermediárias, provavelmente por atividade de células mononucleadas (veja cabeças de seta nas Figuras 3b e 3c), de tal maneira, que os sistemas lamelares haversianos ficavam como que soltos (setas nas Figuras 3b e 3c). Com a continuidade da reabsorção, todos os sistemas lamelares presentes na membrana, eram gradativamente destruídos (veja na Figura 3d, que nessa região só restou um pequeno fragmento da membrana). Com a reabsorção o espaço ocupado pela membrana era substituído, às vezes, por tecido conjuntivo frouxo (Figura 3e) e outras, por tecido conjuntivo fibroso (Figura 3f).
No grupo experimental de 6 meses pós-cirurgia, dois casos exibiram o desaparecimento total da membrana (Figura 4a). Nos outros dois animais um pequeno segmento da membrana ainda estava presente em um dos lados do crânio (Figuras 4b e 4c). No animal da Figura 4b, este segmento da membrana estava unido a superfície do osso parietal e exibia aspecto quase que íntegro, e as bordas em processo de reabsorção. No outro caso (Figuras 4c, 4d, 4e e 4f), as imagens nos sugeriram que tenha ocorrido neoformação óssea junto das suas superfícies craniana e tegumentar, com a sua consequente incorporação (veja Figuras 4c, 4d e 4f). As Figuras 4d, 4e e 4f, mostraram também que o osso neoformado, juntamente com a membrana incorporada, eram , gradativamente reabsorvidos (veja setas nas figuras).
DISCUSSÃO
Várias das técnicas cirúrgicas usadas na periodontia, e nos ultimos 5 a 6 anos com grande intensidade na implantodontia, têm utilizado do princípio biológico da regeneração tecidual guiada. Este princípio está baseado na colocação de uma membrana de material inerte entre o defeito ósseo preenchido com coágulo sanguíneo ou matriz óssea desmineralizada e o tecido mole circunjacente, que funcionaria como uma barreira física impedindo a migração de células do tecido conjuntivo e/ou epitelial para dentro da zona de reparo, criando com isso um microambiente celular e vascular propício para a ocorrência da osteogênese (MILLONIG e TRIPLETT, 1993).
A membrana mais utilizada com grande sucesso, é a de politetrafluoretileno expandido (PTFEe) fabricado pela GoreTex Periodontal Material, que é portanto, o material mais estudado (maiores detalhes sobre este tipo de membrana podem ser obtidos em BUSER, DAHLIN e SCHENK, 1994).
No entanto, segundo SCHULTZ e GAGER(1990), este tipo de membrana exibe várias desvantagens, como a necessidade de um segundo procedimento cirúrgico para a retirada da membrana, a formação ocasional de abcesso e o seu alto custo financeiro.
Deste modo, tem sido lançado no comércio várias membranas reabsorvíveis que não necessitam da segunda intervenção cirúrgica.
Uma membrana que tem alcançado excelentes resultados neste sentido, é a de cortical de fêmur humano desmineralizado (Life Net Tissue Bank Transplant Services) (consultar CALLAN, 1993), mas que tem dois grandes inconvenientes, o seu alto custo e problemas éticos da comercialização de partes de órgãos ou tecidos humanos.
No sentido de contornar estas inconveniências foi lançado no mercado uma membrana liofilizada de cortical de osso bovino desmineralizado (Marca Dentoflex), com as mesmas finalidades.
Deste modo, no presente experimento estudamos o processo de reabsorção deste tipo de membrana, quando colocado em sítio ortotópico na superfície desnuda de calvária de cobaia.
Os resultados histológicos finais obtidos após 6 meses da sua colocação, mostraram que a membrana havia sido totalmente reabsorvida em dois casos (50% ) e quase que totalmente reabsorvida, nos outros dois casos(50%).
Nos chamou atenção em um desses dois últimos casos, a ocorrência de osteogênese nas suas superfícies craniana e tegumentar promovendo a sua incorporação ao osso. A formação desse tecido ósseo poderia ser explicada pela liberação pela membrana de fatores de crescimento tipo BMP (Proteína Morfogenética Óssea), que sabidamente existe no interior da matriz orgânica óssea (URIST et al.,1984; SAMPATH et al.,1987; LUYTEN et al., 1989; BENTZ et al, 1989).
Fato interessante, nesse caso, é que o novo tecido ósseo não tem a capacidade de auto manutenção, provavelmente devido a falta de um estímulo funcional, sendo portanto, gradativamente reabsorvido em conjunto com a membrana incorporada.
A análise histológica nos vários períodos experimentais nos sugeriram que os eventos que levam a reabsorção da membrana de cortical óssea bovina, ocorra na seguinte ordem temporal:
formação de tecido conjuntivo denso recobrindo a membrana;
invasão dos espaços da membrana, correspondentes aos canais de Harvers e Volkmann, por células mononucleadas e vasos sanguíneos;
destruição inicial das porções da membrana correspondentes aos sistemas lamelares intermediários que ficam ao redor dos sistemas lamelares de Havers, provavelmente pela liberação de colagenase pelas células mononucleadas semelhantes a fibroblastos;
ocupação dos espaços, que apareceram no interior da membrana, por novas células mononucleadas;
desaparecimento das porções da membrana correspondentes ao sistemas de Havers e
substituição da membrana, em alguns casos, por tecido conjuntivo denso e em outros, por tecido conjuntivo frouxo;
A reabsorção da membrana, em todos os casos, ocorreu das suas bordas para a sua porção mediana.
Um fato importante que devemos salientar é que em somente um caso no grupo de 1 mês, ocorreu a presença de infiltrado linfocitário associado a membrana, sugerindo que o caráter antigênico da matriz orgânica óssea bovina na cobaia é muito baixo. TAGA et al.(1997) trabalhando com matriz óssea bovina liofilizada (Osseobond) no reparo de lesões ósseas perenes em crânio de cobaias, também observaram a ausência de infiltrado linfocitário durante eventos temporais que levam a reabsorção das partículas de matriz liofilizada e a ocorrência da osteogênese.
Figura 01 - Etapa cirúrgica do experimento:
- a) incisão sagital na região fronto-parietal:
- b) superfície óssea exposta;
- c) membrana de cortical óssea liofilizada:
- d) membrana no tamanho original e recortada com @ 1x2cm:
- e) membrana colocada em posição na superfície óssea; e
- f) a sutura realizada.
Figura 02 -Grupo de 1 mês pós-cirurgia:
a) membrana justaposta a superfície óssea e recoberta por tecido conjuntivo fibroso (setas), H.E., 16X;
b) borda lateral da membrana com aspectos biselados, H.E.,16X;
c) detalhe da membrana, mostrando os espaços dos antigos canais nutritivos ósseos invadidos por células mononucleadas e vasos sanguíneos (cabeça de seta), H. E., 40X;
d) detalhe da figura 2a, mostrando espaços internos contendo células e exibindo superfície interna com aspecto corroído (cabeças de seta), H.E., 40X;
e) caso de presença de infiltrado linfocitário junto ao tecido conjuntivo formado nas superfícies tegumentar e óssea da membrana (setas), H.E., 16X; e
f) detalhe de outra região do mesmo caso anterior observar o tecido conjuntivo superficial e os espaços internos da membrana contendo células mononucleadas (cabeças de seta), H.E., 40X.
FIGURA 03 - Grupo de 3 meses pós-cirurgia:
a) membrana em reab- sorção, observar que a membrana já desapareceu do lado direito( seta) da sutura parietal(cabeça de seta), H.E., 10X;
b) e c) veja como as lamelas ósseas intermediárias estão sendo destruídas por células mononucleadas (cabeça de seta) e os sistemas lamelares haversianos vão ficando soltos (setas) no interior da membrana, H.E.,40X;
d) região da membrana em estado avançado de reabsorção, com pequenos fragmentos de membrana ainda presentes (setas), H.E., 40X;
e) região de membrana substituído por tecido conjuntivo frouxo, H.E., 16X; e
f) região de membrana substituído por tecido conjuntivo denso, H.E.,16X.
FIGURA 04 - Grupo de 6 meses pós-cirurgia:
a) animal em que ocorreu a reabsorção total da membrana(2casos),H.E., 16X;
b) caso em que um segmento da membrana estava presente e justaposto a superfície do crânio, veja a sua borda em reabsorção(seta), H.E., 16X;
c), d) e e) membrana incorporada a superfície óssea por formação de tecido ósseo nas suas superfícies, as setas indicam que a membrana e o tecido ósseo neoformado são juntamente, reabsorvidos, H.E., 16X; e
f) detalhe dafigura 4d, mostrando a reabsorção conjunta da membrana e do tecido ósseo neoformado(.l:etas), H.E., 40X. ..
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao CNPq pela bolsa de iniciação científica concedida C. Y. Hassunuma, o que possibilitou a sua participação no desenvolvimento desse trabalho.
REFERÊNCIA BILIOGRAFICAS